常见生物样本的采集与处理

生物样本库（biobank）是一种集中保存各种人类生物材料，用于疾病的临床治疗和生命科学研究的生物应用系统。

人类生物材料包括生物大分子（DNA、RNA、蛋白质等）、细胞、组织和器官等样本。

近年来，生物样本库发展迅速，保存的人体样本多达几十种，而各个样本库并没有采用标准、统一的低温保存技术和方法，在长期的储存过程中，可能造成所需要的样本信息发生变化。

所以，在探索低温保存机制的基础上，选择合适的低温保存剂、升降温速率等方法处理样本后，储存在合理的温度环境中，是保证生物样本长期保存质量的关键。

                                                                 骅川科技智慧型生物样本库

一、常规样本的采集与保存有何诀窍？

一致：实验组与对照组取样一致性，如组织样本组织块的大小、取样部位，血液样本性别年龄的匹配，尿液样本取样时间等；

除杂：去除与实验无关的杂质，如动物组织去血、植物组织去除泥土等污染物、菌体及细胞去除培养基等，推荐使用PBS缓冲液或者生理盐水，吸水纸吸干残留液体；

低温：样本预处理尽量低温，可以在冰上进行杂质去除和分装的操作，低温保存，通常保存在-80℃冰箱；

分装：根据实验用量进行分装，避免反复冻融；

迅速：样本收集，制备，存储和运输应尽可能的迅速，压缩样本采集到正式实验的时间；

标记：用优质的记号笔清晰的标记好样品名称，以免混淆样本；

包装：建议使用优质的冻存管收集样本，以防在运输和操作过程中样本管破裂并对样本造成污染。妥帖包装，以防运输过程中样本遗失。

1、分子实验 / RNA/DNA
（一）RNA提取（qPCR/测序等）
01.组织样本
组织取材在组织离体 30min 内完成，取样的动作要尽量快速利索，将组织切成任一方向小于 0.5 cm 的薄片（尽可能剪碎），抽取 1ml TRIzol 溶液于 2ml冻存管内，将样本完全浸没于TRIzol溶液(如0.4g样本需要约2.0 mL TRIzol的溶液)。液氮速冻后，-80°C保存。注意：为完全有效的保护组织样本，该组织样本应完全浸没入 TRIzol 溶液中并且组织样本的任何一边的最大厚度不应超过 0.5 cm。因为RNA容易降解如不能立即进行提取实验操作可使用储存在 RNAlocker中，细胞或组织可在室温下稳定保存长达1个星期，在4°C可稳定保存长达1个月，或永久保存在-20°C。

02.细胞样本细胞收集后用PBS缓冲液快速洗一次，每5×106个细胞加入1 ml TRIzol，用枪头反复抽打，直至看不见成团的细胞块，整个溶液呈清亮而不粘稠的状态；液氮速冻，-80℃保存。
03.血液样本

1) 加入1 ml TRIzol和200-300μL新鲜血液（TRIzol:血液 = 3:1~5:1），用移液器吹打几次以帮助裂解样品中的细胞；

2) 样品剧烈震荡混匀1~2 min，直到絮状物全部溶解；

3) 室温孵育5 min以使核蛋白体完全分解；

4) 写好编号，封口膜封存，-80℃冻存。注意：冰冻血液溶解过程中会有破碎的细胞释放RNA酶，因此建议在冰冻前加入TRIzol，切勿直接冻存新鲜血液，保存好的血液应避免反复冻融。
04. 运输条件：干冰运输。

（二）、DNA提取
1.组织样本
取材后，PBS清洗2-3次，液氮速冻，-80℃保存；
2.细胞样本
细胞收集沉淀后，液氮速冻，-80℃保存；
3.运输条件：冰袋运输。

2、蛋白实验 / WB/ELISA

01.组织样本
取新鲜组织，用无尘纸快速吸去血液，将组织剪成小块，放入装有液氮的锡箔纸中速冻后，放入液氮预冷的离心管中，液氮速冻5min后，-80 ℃保存。
02.细胞样本
收集细胞悬浮液于1.5ml的离心管中，离心去上清，PBS洗涤三次，液氮速冻5min后，-80 ℃保存。
03.血清样本
收集全血，室温放置2h，4℃ 3000rpm/min 离心10min，吸取上部的血清即可，-80 ℃保存。
04.运输条件：干冰运输
全血：新鲜抗凝血，避免剧烈震荡，避免凝血；立即提取。

3、病理实验 

（一）石蜡切片
1. 组织样本
取材后，PBS清洗2-3次，使用4%多聚甲醛固定，组织样本需完全浸泡在固定液中，固定液的容量应足够，一般固定液与组织块的体积比率应大于10:1。室温保存。
注意：取材样本要新鲜，否则细胞内溶酶体会破裂，造成细胞自融。
2. 细胞样本
细胞爬片后，4%多聚甲醛固定30min，换PBS浸没4度保存。
3. 运输条件：常温运输;
4. 其他组织保存、固定等。

（二）冷冻切片
1. 动物组织样本
①1-3min内取样，取样组织2mmX2mm大小，尽量薄。如来不及修整组织大小，可先于电镜固定液内固定半小时左右，待组织变硬以后再修整组织进行后固定。超出此范围后组织会无法完全固定，后续实验无法完成，务必请重视此过程。
② 取材时尽量精确到需要观察的目的部位（如观察肾小球取肾皮质；观察胰岛取胰岛丰富的胰尾；皮肤，肠胃等在固定液中易打卷的组织可将组织粘在滤纸上进行固定）。
③ 取材时一定注意避免镊子挤压等机械损伤，刀片要锋利避免挫伤组织。
④ 组织取下后立即投入电镜固定液内室温固定2h，再转移至4℃保存，4℃冰袋运输，在保存和运输过程中固定液切勿冷冻结冰。4℃时样本可保存1个月左右。

2. 细胞样本
贴壁细胞：
实验目的重点观察细胞连接，将培养好的细胞弃培养基，不经漂洗迅速加电镜固定液，用细胞刮沿一个方向轻轻刮下细胞收集到离心管内（避免刮破细胞）。实验目的重点观察细胞器，对细胞形态形状无特殊要求，用胰酶消化，离心收集细胞要肉眼可见细胞沉淀芝麻至绿豆大小，弃固定液后加新的电镜固定液室温固定2h，再转移至4℃保存，4℃冰袋运输，在保存和运输过程中，固定液切勿冷冻结冰。
悬浮细胞：
离心收集细胞要肉眼可见细胞沉淀芝麻至绿豆大小，弃培养基后加电镜固定液室温固定2h，再转移至4℃保存，4℃冰袋运输，在保存和运输过程中，固定液切勿冷冻结冰。