【PCR科普】PCR原理和步骤

聚合酶链式反应（PCR）是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，它可看作是生物体外的特殊DNA复制，PCR的最大特点是能将微量的DNA大幅增加。

原理——DNA的半保留复制

DNA 在进行复制的时候链间氢键断裂，双链解旋分开，每条链作为模板在其上合成互补链，经过一系列酶的作用生成两个新的DNA分子。

PCR技术步骤

变性：（90℃-96℃）：双链DNA模板在热作用下，氢键断裂，形成单链DNA。

退火：（60℃-65℃）：系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部双链。

延伸：（70℃-75℃）：在Taq酶（在72℃左右，活性最佳）的作用下，以dNTP为原料，从引物的3′端开始以从5′→3′端的方向延伸，合成与模板互补的DNA链。

每一循环经过变性、退火和延伸，DNA含量即增加一倍。如图所示：现在有些PCR因为扩增区很短，即使Taq酶活性不是最佳也能在很短的时间内复制完成，因此可以改为两步法，即退火和延伸同时在60℃-65℃间进行，以减少一次升降温过程，提高了反应速度。

在其上合成互补链，经过一系列酶的作用生成两个新的DNA分子。

PCR模板

   PCR的模板可以是DNA，也可以是RNA。模板的取材主要依据PCR的扩增对象，可以是病原体标本如病毒、细菌、真菌等。也可以是病理生理标本如细胞、血液、羊水细胞等。法医学标本有血斑、精斑、毛发等。标本处理的基本要求是除去杂质，并部分纯化标本中的核酸。多数样品需要经过SDS和蛋白酶K处理。难以破碎的细菌，可用溶菌酶加EDTA处理。所得制DNA，经酚、氯仿抽提纯化，再用乙醇沉淀后用作PCR反应模板。

PCR引物设计

    PCR引物设计PCR反应中有两条引物，即5′端引物和3′引物。设计引物时以一条DNA单链为基准（常以信息链为基准），5′端引物与位于待扩增片段5′端上的一小段DNA序列相同；3′端引物与位于待扩增片段3′端的一小段DNA序列互补。

（1）引物设计的基本原则引物长度：15-30bp，常用为20bp左右。引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C 过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列参照。引物内部不应出现互补序列。两个引物之间不应存在互补序列，尤其是避免3 ′端的互补重叠。引物与非特异扩增区的序列的同源性不要超过70%，引物3′末端连续8个碱基在待扩增区以外不能有完全互补序列，否则易导致非特异性扩增。引物3‘端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，最佳选择是G和C。引物的5′端可以修饰。如附加限制酶位点，引入突变位点，用生物素、荧光物质、地高辛标记，加入其它短序列，包括起始密码子、终止密码子等。

（2）引物设计软件Primer Premier5.0 （自动搜索）vOligo6 （引物评价）vVector NTI SuitvDNAsisvOmigavDNAstarvPrimer3 （在线服务）

dNTPs

    dNTPs（核苷酸）由四个基本核苷酸组成。

缓冲体系

    PCR buffer能够为DNA聚合酶活性提供适宜的化学环境。缓冲液pH通常为8.0-9.5，一般使用Tris-HCl来调节。镁离子作为DNA聚合酶活性的辅助因子，有助于聚合期间dNTP的结合。酶活性位点处的镁离子可催化引物的3′-OH与dNTP的磷酸基团间形成磷酸二酯键。此外， Mg2+ 能够稳定磷酸盐骨架上的负电荷，从而促进引物与DNA模板形成复合物。缓冲液的一个常见成分是来自KCl的钾离子，其可促进引物的吸附。也可使用硫酸铵(NH4)2SO4 代替KCl。铵离子(NH4+) 具有去稳定作用，尤其对于错配引物-模板复合物碱基对之间的弱氢键，因此可增强反应特异性。

DNA聚合酶

DNA聚合酶是PCR的重要组成部分，它们能够从单链DNA模板合成新的互补链。所有DNA聚合酶都具有 5′→ 3′ 聚合酶活性，即掺入核苷酸并使引物从按5'至3’方向延伸。

TaqDNA 聚合酶是从一种嗜热细菌中分离出来的，Taq DNA 聚合酶具有极高的热稳定性，或许能够承受 PCR 的热变性步骤。Pfu DNA聚合酶是一种为大家所熟知的超耐热酶，来自于水热环境中的超嗜热古细菌 Pyrococcus furiosus。在95°C下，Pfu聚合酶的稳定性能比 Taq聚合酶高20倍。高保真DNA聚合酶：其校正活性基于其 3′ → 5′核酸外切酶活性，可校正错误插入的核苷酸。DNA聚合酶上的核酸外切酶活性位点与其5′→ 3′聚合酶活性位点是分离的。当错配的核苷酸插入聚合结构域，DNA合成将因不合适的碱基配对动力学而暂停。暂停期间，DNA聚合酶将切除错配的核苷酸并用正确的核苷酸替换。

PCR实验操作

在进行基因克隆或者载体构建的实验中我们使用高保真DNA聚合酶

按照说明书准备高保真酶mix、DNA模板、引物、双蒸水

查看引物单信息，核对引物浓度和Tm值

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