数字PCR原理技术及应用

疫情之后，PCR技术成为了极度普及的基础技术，各种产品如雨后春笋出现，其中荧光定量PCR竞争白热化，产品开发已达平台期。

在选择新的技术方向时，数字PCR或许也是一种不错的选择。让我们一起学习下...

1.数字PCR的概念

1988年，Kary Mullis验证了基因在稀释到极低的丰度（达到单分子水平）后，经过40个热循环步骤依旧可以扩增到能够检测到的量。该实验证实了单分子模板可以扩增的事实，为数字PCR单分子检测技术打下了基础。1992年，Sykes等人提出了一种基于有限稀释的核酸定量方法，该方法提出了一个重要的原则：以“终点信号的有或无（all-or none end point）”作为反应单元阴阳性的判断标志，该方法是数字PCR技术的理论基础。1999年，Kinzler和Vogelstein等明确提出了数字PCR的概念，他们通过有限稀释的策略，对致癌基因KRAS突变型进行了定量分析。如图1-1所示，首先，DNA样本被稀释到很低的浓度，约0.5个拷贝每孔，然后把样本分散到独立的反应单元内，并在经过优化的实验条件下进行PCR扩增；然后，加入荧光探针，对每个独立反应孔内的荧光信号进行检测分析，根据荧光信号强度判断每一个独立反应单元内的PCR扩增产物中是否存在野生型和突变型DNA序列；最后根据相应比例的突变和野生DNA数目，进行突变频率的判定。该实验限于当时技术条件的局限性，样本分割的过程是在384孔板中进行的。其操作过程的复杂性，限制了数字PCR技术的发展，导致数字PCR在较长的一段时间内，发展相对缓慢。

图1数字PCR技术原理。

2. 基于泊松分布的核酸定量原理

图2是数字PCR的检测流程，数字PCR最核心的技术策略在于把模板分子随机的分配到数万甚至数百万个独立的反应单元中，理想状态下使每个反应单元中包含1个或者不包含模板分子，被分割的模板分子在独立的反应单元内进行扩增反应，在扩增终点，通过荧光染料或探针技术检测每一个独立反应单元中的荧光信号，根据信号差异，可以直接计数出出含有模板分子的反应单元个数，进而直接实现反应液中模板分子浓度的定量。然而，在实际操作中，模板分子在随机分散时会出现两个甚至多个模板分子进入到同一个反应单元内的情况发生，而在扩增终点，含有模板分子的反应单元具有相同的荧光强度，难以区分多个模板和一个模板的反应单元。所以，简单的通过阳性分区的个数来直接统计模板分子个数的方式会导致定量结果出现较大的偏差，尤其是在模板浓度较高的情况下。为了解决这个问题，多种统计学方法被用来进行数字PCR的模板分子定量。其中，最常用的一种统计学方法是泊松分布。

图 2 数字PCR检测流程。

基于泊松分布的数字PCR定量原理可以简单描述如下：假设模板分子在溶液中是均匀分散的，个分子随机分布到个反应单元中，这种情况对应于一个二项式过程，即每个过程的结果要么出现要么不出现，并且重复次。目标分子出现在一个反应单元中的概率是，因为它是随机事件或独立事件的结果。一个反应单元有次机会分配到一个目标分子。一个反应单元在一次分配之后为空的概率是，在次尝试之后是，最后为空的反应单元的概率。在很大(很小)的情况下，()可以看作是的一阶近似。因此，概率可以近似为，这里λ为反应单元中所含有的平均分子拷贝数，为阴性反应单元数目。因此，已知阳性反应单元个数，即可实现原始样本中模板分子的定量，平均分子拷贝数，这个公式定义了数字PCR泊松分布的概率函数。

3. 数字PCR技术优势

数子PCR技术与第一代PCP（定性PCR技术）、二代PCR技术（相对定量PCR技术）相比，具有很多优势：

1）特异性、灵敏性均有显著提高；

2）在不依赖内参和标准曲线的前提下，直接得到绝对定量结果；

3）不需要大量复杂的相对定量计算，直接呈现靶分子原始浓度/拷贝数；

4）微反应单元相互独立、封闭，避免了PCR抑制剂及不同核酸分子扩增产物间的相互干扰，极大的提高了检测的准确度和可重复性。

表1. 数子PCR与荧光定量PCR技术比较

	数字PCR（dPCR）	荧光定量PCR（qPCR）
检测灵敏度	0.01%(高)	1%（低）
是否绝对定量	是	否
特异性	高	一般
数据重复性	高	一般
是否需要标准曲线	否	是
检测方法	Taqman探针和染料法	Taqman探针和染料法
抗干扰能力	很强	弱
检测价格	略高	低

4.  数字PCR技术路线——固相分割技术 vs 油包水分割技术

数字PCR根据液滴分割方式的不同，数字PCR产品主要分为固相分割芯片和油包水式等。不论是哪种形式的数字PCR产品，整体上都由微反应单元生成、扩增信号检测与分析两个部分组成。

其中，微流控芯片式的体系兼容性更高，芯片工艺较为复杂；油包水系统简单，但是体系变化时易发生破裂和融合，导致定量结果出现偏差。

表2. 数字PCR技术路线比较（微孔固相分割技术 vs 油包水分割技术）

数字PCR技术路线	固相分割法	油包水分割法
液滴均一性	均一性高，cv<1%	均一性弱，cv>5%
有效液滴率	高，>95%	低，<80%
信号信噪比	高，阴阳性信号区分能力高	低，阴阳性信号区分能力弱
第三方试剂兼容性	兼容第三方试剂，快速开发应用试剂盒，使用成本低	不兼容，试剂封闭，应用开发慢，使用成本高

5. 数字PCR市场和应用

目前，在我国市场中用于基因检测的技术主要分为PCR技术、基因测序技术、FISH技术和基因芯片技术四种。其中PCR技术包括普通PCR、荧光定量PCR和数字PCR。测序包括一代测序、二代测序和三代测序等。

根据技术和市场发展进度，数字PCR属于快发展阶段，在临床检测、科学研究、生物制药和计量等领域发挥着不可替代的作用。

图3 数字PCR发展阶段

作为第三代的PCR技术，数字PCR具有独特的应用优势。

在肿瘤伴随诊断方面：数字PCR通过检测患者血液DNA/RNA，可以了解患者肿瘤发生发展，如通过血液检测肺癌EGFR、BRAF、KARS等基因实现肿瘤伴随诊断。

另外，数字PCR被誉为基因检测领域，灵敏度最高（0.01%）的检测技术，对于很难取得肿瘤组织的样本，数字PCR可以通过检测体液样本（血液、唾液、尿液和痰液等）实现肿瘤检测。

在遗传生殖方面：数字PCR具有极佳的信噪比，在遗传生殖方面发挥了巨大作用，如SAM，NIPT等检测。目前NIPT主要用高通量测序技术，但是检测时间长、成本高、需要专业的技术团队，而且很难在院内落地，尤其是二/三线城市医院。数字PCR检测只需要4小时左右，相比NGS可以降低2/3的成本，可以很快在二/三线城市医院落地，具有更高的经济效益。

对于SMA的检测：数字PCR可以同时检测SMN1和SMN2，国内SMA治疗药物已经进入医保，SMN2的定量检测可以指导用药，而数字PCR可以精准实现SMN2拷贝数定量，其作用也是不可替代的。

针对病原微生物和食源性致病菌检测：数字PCR检测时间是3小时左右，可实现快速、精准的定量检测需求。

小海龟超多重数字PCR单个反应可以同时检测15-20种病原体，满足病原体超多重检测的需求。

在计量研究领域：数字PCR是核酸标准品定量的行业标准；

在核酸药物质控领域：数字PCR是rAAV、mRNA疫苗、Car-T等生物药的最佳剂量质控技术。

对于环境微生物：数字PCR具有极高的抑制物耐受性，可以精准实现环境DNA定量监控，适用于多种生态学研究。

图4  数字PCR热门研究方向