流式细胞术的样品制备

流式细胞术的样品制备

流式细胞术的实验检测对象是单细胞悬液，因此需把样品制备成细胞悬液，细胞浓度为10⁵～10⁷个／ml。制备成的单细胞悬液经荧光或免疫荧光标记即可上机检测。

样本制备的基本原则：1.使各种液体和悬浮细胞样本新鲜，尽快完成样本制备和检测；2.针对不同的细胞样本进行适当洗涤、酶消化或EDTA处理，以清除杂质，使粘附的细胞彼此分离而形成单细胞状态；3.对新鲜实体瘤组织可选用或联用酶消化法，机械打散法和化学分散法来获得足够数量的单细胞悬液；4.对石蜡包埋组织应先切成若干40-50μm厚的蜡片，经二甲苯脱蜡到水后，再用前述方法制备单细胞悬液；5.单细胞悬液的细胞数不应少于10⁷个/ml。

 一、新鲜实体组织样本的制备

 （一）酶处理法  此法是实体组织分散为单个细胞的主要方法。由于不同酶对细胞内和细胞间不同组分有特异消化作用，所以应根据所用组织类型确定使用酶的种类。此外，乙二胺四乙酸(EDTA)能结合组织中的二价钙离子和镁离子，而二价钙离子和镁离子有维持细胞表面完整性和维持细胞间质结构的作用，因此，几种酶和EDTA联合使用有助于充分消化实体组织，提高细胞产出效率。下面仅介绍组织消化的一般过程，对于每种组织消化时所用的具体步骤需参考该组织细胞培养时的消化方法。

1．将组织剪成l～2mm3左右的小块。

2．用胰蛋白酶或胶原酶消化组织块，胰蛋白酶适用于消化细胞间质较少的软组织，如胚胎、上皮、肝、肾等组织。胰蛋白酶工作浓度一般为0．1％～0．5％。对于纤维较多的组织或较硬的癌组织常用0．25％胶原酶，胶原酶对组织中胶原蛋白类结构消化作用强，它仅对细胞间质有消化作用而对上皮细胞影响不大。胶原酶常用剂量为0．1～0．3ug／ml。用大于组织量30～50倍的胰蛋白酶液或胶原酶液在37℃条件下消化组织，需每隔一定时间摇动一次。消化时间的长短依组织类型而定，一般来说，胰蛋白酶需作用20～60分钟，胶原酶需4～48小时。在消化过程中，如发现组织块已分散而失去块的形状，经摇动即可成为絮状悬液，则可取出少量液体在显微镜下观察，可见分散的单个细胞和少量的细胞团，可认为组织已消化充分。

3．消化完毕后，将细胞悬液通过100目孔径尼龙网或不锈钢网滤过，以除掉未充分消化的组织。

4．已过滤的细胞悬液经800～1000rpm低速离心5～10分钟后，弃上清液，加PBS液，轻轻吹打形成细胞悬液，细胞计数后即可使用。

（二）机械法  机械法分散实体组织，用手术剪刀剪碎组织、用锋利的解剖刀剁碎组织或用匀浆器制成组织匀浆，再用细注射针头抽吸细胞或用300目尼龙网滤除单细胞悬液；采用网搓法也能获得大量细胞。机械法易造成细胞碎片和细胞团块，所以常与其他方法配合使用。

1．剪碎法

（1）将组织块放入平皿中，加入少量生理盐水；

（2）用剪刀将组织剪至匀浆状；

（3）加入10ml生理盐水；

（4）用吸管吸取组织匀浆，先以100目尼龙网过滤到试管中；

（5）离心沉淀1000r/min，4~5min，再用生理盐水洗3遍，每次以低速（500~800r/min）短时离心沉淀去除细胞碎片。

（6）以300目尼龙网滤去细胞团块；

（7）细胞用固定液固定或低温保存备用。

2．网搓法

（1）将100目、300目尼龙网扎在小烧杯上；

（2）把剪碎的组织放在网上，以眼科镊子轻轻搓组织块，边搓边加生理盐水冲洗，直到将组织搓完；

（3）收集细胞悬液，500~800r/min离心沉淀2min；

（4）固定细胞或低温保存备用。

3．研磨法

（1）先将组织剪成1~2mm2 大小组织块；

（2）放入组织研磨器中加入1~2ml生理盐水；

（3）转动研棒，研至匀浆。

（4）加入10ml生理盐水，冲洗研磨器；

（5）收集细胞悬液，并经300目尼龙网过滤，离心沉淀500~800r/min，1~2min，再以生理盐水水洗3遍，离心沉淀；

（6）固定或低温保存细胞悬液，备用。

二、组织活检、内镜取材标本单细胞悬液的制备

正常组织、瘤组织和淋巴结等活检组织以及内镜（胃镜、食管镜等）取材标本，由于材料较少、制备起来比较麻烦，但其制备方法与实体组织基本相似。

1．取材后立即放入盛有少许PBS液的青霉素小瓶中；

2．另取一只小烧杯，杯口用300目尼龙网盖住，用线绳固定好，并用PBS液湿润；取新鲜组织标本置尼龙网上，因标本量少，尤其是内镜取材至少要取3块以上。

3．在操作前，先将剪刀用PBS液浸润一下，然后开始剪碎组织；

4．先剪几下，视基本无组织块存在时，用原来装标本的青霉素小瓶中的PBS液，冲洗细胞匀浆并过滤于小烧杯中，如果这时仍有可见组织块，再用剪刀剪碎，再加适量该PBS液冲洗，直至网上无组织块为止。这样可尽量多地收集细胞。

5．细胞加固定液或低温保存，备用。

三、石蜡包埋组织的流式细胞样品制备 

外科手术获得的新鲜实体组织，往往已进行石蜡包埋处理。石蜡包埋组织单细胞分散方法的建立，扩大了流式细胞术的应用范围。

1．把石蜡包埋组织切成10~50um厚的组织片3~5片，或用乳钵研成0.5mm直径大小颗粒状，放入10ml的试管中；

2．加入二甲苯5~8ml，在室温下脱蜡1~2天，视石蜡脱净与否，更换1~2次二甲苯，石蜡脱净后，弃去二甲苯；

3．水化：依次加入100%、95%、70%、50%梯度乙醇5ml，每步为10min，去乙醇，加入蒸馏水3~5ml，10min后弃之；

4．消化：加入2ml 0.5%胰蛋白酶（pH 1.5~2.0）消化液，置37℃恒温水浴中消化30min，在消化期间，没隔10min用振荡器振荡1次；

5．消化30min后，立即加生理盐水终止消化；

6．经300目尼龙网过滤，未消化好的组织可做第二次消化；

7．收集细胞悬液，离心沉淀1500r/min，再以生理盐水洗涤1~2次，离心沉淀500~800r/min，去碎片；

8．保存细胞备用。

四、外周血单个核细胞的制备

1．取外周血2ml，肝素抗凝，用生理盐水将血稀释成4ml，混匀；

2．将稀释后的血液沿试管壁徐徐加入4ml淋巴细胞分离液ficoll到液面之上，勿用力过大，以免造成血液与分离液混合，保持清晰地分层状态；

3．离心2000r/min，30min，室温18~20℃，离心后可见试管内的血液清楚地分为4层，上层为血浆层，中层为分离液层（单个核细胞处于血浆层和分离液层中间），底层为红细胞层，红细胞层上为粒细胞层；

4．用吸管将上层与中层之间的单个核细胞层吸出收集到另1试管中，用生理盐水洗2遍，每次均以1500r/min，离心10min，弃上清后即得到高纯度的单个核细胞悬液；

5．用适当的固定液固定或置低温冰箱保存待用。

五、骨髓细胞单细胞悬液的制备

1．无菌抽取骨髓液0.5ml;

2．将骨髓标本滴入含1000U/ml肝素抗凝剂的1ml PBS液中；

3．再加入PBS液稀释至10ml；

4．用吸管吸取5ml稀释骨髓液徐徐加入盛有4ml的人类淋巴细胞分离液液面之上；

5．以上条件下，骨髓有核细胞分层在PBS-人类淋巴细胞分离液之间形成的界面上；

6．取有核细胞层，加入到10ml PBS液中，混匀；

7．以1000r/min离心5min，弃上清，收集骨髓细胞，加固定液或置低温冰箱备用。

六、单层培养细胞单细胞悬液的制备

1．弃去培养细胞(对数生长期)中的旧培养液，加入1～2ml 0．25％胰蛋白酶，倒置显微镜下观察，见细胞稍变圆时，停止胰蛋白酶作用。也可直接观察培养瓶，静置消化2～3分钟，待细胞逐渐变白，有脱落趋势时，立即竖立培养瓶，停止胰蛋白酶作用，弃去胰蛋白酶；

2．加入3～4ml无钙离子和镁离子的PBS液，用吸管反复吹打，使其分散为单个细胞悬液，移人离心管中；

3．短时低速离心，即800~1000r/min，离心5min；

4．去掉上清液，加入5~8ml PBS液，低速短时离心，800~1000r/min，离心3~5min；重复2~3次，以去除细胞悬液中的细胞碎片。

5．加少许PBS液，将沉淀细胞轻轻吹打均匀。加固定液或低温保存待用。

七、脱落细胞单细胞悬液的制备

在临床工作中，可以收集到大量自然脱落细胞，这些细胞标本经过简单处理，便可成为较好的单细胞悬液供流式细胞术分析。主要包括脱落细胞、胸腹水细胞、尿液、内镜刷检细胞等。

（一）食管拉网细胞的单细胞悬液的制备

1．将食管拉网器上的细胞洗脱到20ml PBS液中，以1500r/min离心后，再用PBS液洗2次，离心500~800r/min，1~2min，弃上清；

2．再加入PBS液5ml，以300目尼龙滤网过滤，离心沉淀去上清；

3．加少许PBS液混匀沉淀细胞，加固定液或低温保存，备用。

（二）尿液脱落细胞的单细胞悬液的制备

1．用以清洁器皿收集24h尿液，置4℃冰箱中自然沉淀2h，轻轻倒去上清液，留下少许带细胞的沉淀物，用吸管移至10~20ml离心管中；

2．500r/min离心10min，去上清；

3．加PBS液8~10ml，以1000r/min离心10min，去上清，重复再洗1次；

4．再加5ml PBS液混匀，用300目尼龙滤网过滤，离心沉淀去上清；

5．再加少许PBS液，混匀。加固定液或低温保存，备用。

（三）胸、腹水脱落细胞的制备

1．抽取胸、腹水50~100ml，加入1000U/ml肝素液1ml，放盐水瓶中置于4℃冰箱中静置6~12h，弃去上清；

2．将底部10~20ml用长吸管移入试管中，用PBS液洗3次，以1500r/min离心沉淀5min；

3．再加5ml PBS液混匀，用300目尼龙滤网过滤，离心沉淀去上清；

4．加少许PBS液，混匀；加固定液或低温保存，备用。

（四）冲洗液细胞样品的制备

1．用300~500ml生理盐水冲洗膀胱，冲洗一定时间后，吸出冲洗液放入容器中于冰箱内置6~12h；

2．取沉淀液20~40ml，离心沉淀并以生理盐水洗2次，吸上清；

3．加10ml PBS液，混匀，以300目尼龙滤网过滤，离心沉淀去上清；

4．过滤后1000r/min，10min，离心沉淀，去上清；加固定液或低温保存备用。